Mewn arbrofion PCR (adwaith cadwyn polymeras), gall pecynnu ymddangos yn syml, ond mae'n effeithio'n uniongyrchol ar sefydlogrwydd ymweithredydd, rhwyddineb ei ddefnyddio, a chanlyniadau dibynadwy. P'un a yw storio a chludo labordy - yn paratoi adweithyddion neu premixes masnachol, gall meistroli technegau pecynnu PCR cywir osgoi gwallau cyffredin a gwella effeithlonrwydd arbrofol. Isod, rydym yn rhannu awgrymiadau ymarferol ar ddewis deunyddiau, strategaethau pecynnu, a manylion storio.
I. Dewis Deunydd Pecynnu: Blaenoriaethu Cydnawsedd ac Amddiffyniad
Mae adweithiau PCR yn sensitif i dymheredd, golau a halogion, felly mae'n rhaid i ddeunyddiau pecynnu fodloni tri gofyniad allweddol: aerglawdd, golau - atal, ac anadweithiol cemegol.
Ar gyfer tiwbiau centrifuge a phlatiau PCR, mae'n well gan polypropylen (PP), oherwydd ei dryloywder uchel a dNase/rnase - priodweddau rhydd . 0.2 ml tenau {{}} Mae tiwbiau pcr muriog ar gyfer trosglwyddo pcr, tra bod tiwbiau crynhoad cyflym ar gyfer trosglwyddo cyflym, tra bod tiwbiau pcr yn cael eu clymu ar gyfer trosglwyddo cyflym, er bod tiwbiau pcr yn cael eu clymu, yn cael eu clymu ar gyfer trosglwyddo cyflym, ar gyfer trosglwyddo cyflym, yn cael eu clymu ar gyfer trosglwyddo cyflym, ar gyfer trosglwyddo cyflym. Ar gyfer platiau PCR 96 - yn dda, rydym yn argymell dewis dyluniad sgert (er hwylustod trin robotig) neu ddyluniad heb sgert (ar gyfer cadwraeth gofod).
Dull Selio: Mae tiwbiau centrifuge confensiynol yn defnyddio capiau gwastad neu wedi'u codi (i atal anweddu a sychu). Fodd bynnag, ar gyfer storio term hir -, argymhellir gwres - ffilm selio (fel parafilm) neu ffilm anadlu (fel aeraseal) i gydbwyso pwysau mewnol ac allanol. Argymhellir platiau PCR i ddefnyddio sealers ffoil alwminiwm gludiog (uchel - gwrthsefyll tymheredd) neu hunan - ffilm gludiog (ar gyfer defnydd sengl -).
Amddiffyniad golau: Dylai'r adweithyddion sy'n cynnwys golau - cynhwysion sensitif (fel llifynnau penodol neu brimynnau) gael eu lapio mewn ffoil alwminiwm, neu ddylid defnyddio platiau PCR du (ar gael gan rai gweithgynhyrchwyr).
II. Technegau Aliquotio: Lleihau colledion o rewi dro ar ôl tro - cylchoedd dadmer
Mae Aliquoting Reacents yn gam craidd mewn pecynnu PCR ac mae'n effeithio'n uniongyrchol ar atgynyrchioldeb arbrofol.
Meistr Aliquotio Cymysgedd: Argymhellir bod cymysgeddau meistr masnachol (fel ensym TAQ a chymysgedd DNTP) yn cael eu aliquotio yn seiliedig ar gyfaint yr adwaith ynghyd ag ymyl 5% - 10% 10% (ee, ar gyfer adwaith 20 μl, aliquot 22 μl y tiwb). Ceisiwch osgoi defnyddio'n uniongyrchol o becynnu swmp, fel rhewi dro ar ôl tro - gall cylchoedd dadmer arwain at lai o weithgaredd ensymau (gall ensym TAQ golli tua 5% o weithgaredd fesul cylch rhewi-dadmer).
Primers a Templedi: Argymhellir bod primers (yn enwedig primers arfer) yn cael eu aliquotio o ddatrysiadau stoc 100 μm a'u storio ar - 20 gradd. Gwanhewch i grynodiad gweithio (0.1-1 μm fel arfer) cyn ei ddefnyddio. Dylai templedi fel DNA genomig gael eu aliquotio mewn meintiau sengl - i osgoi croeshalogi.
Awgrymiadau atal halogi: Sicrhewch fod tiwbiau centrifuge yn sych cyn aliquotio (gall ethanol gweddilliol atal PCR), cyn - awgrymiadau pibed cŵl i atal adweithyddion oer rhag glynu wrth y wal, a gwisgo menig trwy gydol y broses gyfan i osgoi halogiad DNA croen.
Iii. Labelu a Chadw Cofnodion: Osgoi'r trap "Blwch Du"
Mae labelu clir yn hanfodol ar gyfer pecynnu PCR; Gall labelu anghywir ddifetha'r arbrawf cyfan.
Gwybodaeth labelu gorfodol: Enw ymweithredydd (ee, "2 × Taq Mastermix"), crynodiad/cynnwys (ee, "10 mm dntps"), rhif swp (ar gyfer olrhain), amodau storio (ee, "-20 gradd wedi'i amddiffyn rhag golau"), dyddiad aliquot, a dyddiad dod i ben (Eg, "o fewn 6 mis").
Labelu Arbennig: Os yw'r ymweithredydd yn cynnwys glyserol (gwrthrewydd), llifynnau (ee, gwyrdd SYBR), neu ychwanegion (ee, BSA), rhaid darparu gwybodaeth ychwanegol (ee, "yn cynnwys 50% glyserol, peidiwch â storio ar dymheredd uchel").
Cydamseru Cofnodion: Argymhellir defnyddio taenlen neu feddalwedd rheoli labordy (ee Labguru) i gofnodi paramedrau manwl cynnwys pob tiwb (ee dilyniant primer, gwerth TM) a'u cysylltu â rhif y label corfforol.
Iv. Storio a chludo: Cydbwyso tymheredd ac amddiffyniad corfforol
Mae sefydlogrwydd adweithyddion PCR yn ddibynnol iawn ar amodau storio, ac mae angen amddiffyniad ychwanegol wrth gludo.
Storio Cyffredinol:
Ensymau (Taq, reverse transcriptase): Hir - Storio tymor ar - 20 gradd (osgoi cylchoedd rhewi -dadmer dro ar ôl tro; aliquot a storio ar -80 gradd i'w defnyddio yn y dyfodol);
Primers/Probes: Storiwch ar -20 gradd am dros flwyddyn (os yw'n cynnwys grŵp wedi'i addasu fel biotin, amddiffyn rhag golau);
Non - Buffers ensym (ee, PBS): Storio tymor byr - ar 4 gradd (hyd at 1 mis).
Gofynion Trafnidiaeth:
Ar gyfer cludo cadwyn oer, defnyddiwch rew sych (- 78 gradd) ar gyfer ensymau (a gynhelir o dan -20 gradd), a rhew glas (tua 0 gradd) ar gyfer byfferau ar gyfer cludo tymor byr.
Osgoi dirgryniad gormodol (dylid sicrhau platiau PCR mewn blychau ewyn i atal cymysgu adweithyddion rhwng ffynhonnau).
Yn ystod tymereddau uchel yr haf, ychwanegwch haen inswleiddio at y deunydd pacio (ee bag inswleiddio ffoil alwminiwm + pecyn gel wedi'i rewi).
V. Problemau ac atebion cyffredin
Problem 1: dyodiad ymweithredydd (ee dyodiad DNTPS neu MGCL₂ ar dymheredd isel) → Datrysiad: Centrifuge byr (1000 rpm, 1 munud) cyn aliquotio. Hydoddi mewn deorydd 37 gradd cyn ei ddefnyddio a fortecs i gymysgu'n drylwyr.
Problem 2: Mae Sealer Plât yn hawdd ei dynnu → Datrysiad: Dewiswch Heat - Sealer gwrthsefyll gyda chefn gludiog, neu defnyddiwch sealer gwres (sy'n addas ar gyfer arbrofion trwybwn - uchel).
Problem 3: Labeli aneglur → Datrysiad: Defnyddiwch farciwr gwrth -ddŵr (fel miniog) neu laser - labeli print i atal llawysgrifen rhag cael ei ddileu gan alcohol.
Nghasgliad
Mae pecynnu PCR yn fwy nag adweithyddion "pecynnu" yn unig; Dyma'r llinell amddiffyn gyntaf ar gyfer dibynadwyedd arbrofol. Trwy ddewis deunyddiau priodol, safoni'r broses aliquotio, cynnal labelu trylwyr, a chynnal rheolaeth tymheredd caeth wrth eu cludo, gallwch leihau gwall dynol yn sylweddol, gan sicrhau adweithiau ymhelaethu dilynol mwy sefydlog a chanlyniadau mwy dibynadwy. Cofiwch: Manylion Pennu Llwyddiant. Gall arferion pecynnu PCR cywir arbed datrys problemau amser sylweddol trwy gydol eich arbrawf cyfan!